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耐甲氧西林葡萄球菌的多重PCR快速检测

2017-11-04 03:00:11    作者:admin    www.5alw.com

                                       作者:牟晓峰 陈文 闫志勇 王斌

【关键词】  葡萄球菌感染;甲氧西林抗药性;聚合酶链反应
  [摘要]目的 采用多重聚合酶链反应(PCR)检测耐甲氧西林葡萄球菌(MRS),并对我院葡萄球菌的耐药率进行调查。方法 对262株葡萄球菌(金黄色葡萄球菌86株,凝固酶阴性葡萄球菌176株)进行多重PCR扩增,并与琼脂稀释法作比较。对我院葡萄球菌的耐药率进行统计分析。结果 以mecA基因阳性判断MRS,灵敏度为100%,特异度为96.6%,阴性预测值为100%,阳性预测值为99.0%;以mecA基因和femA基因阳性判断耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),灵敏度为100%,特异度为99.5%,阴性预测值为100%,阳性预测值为98.5%。我院葡萄球菌耐药率为78.6%,其中凝固酶阴性葡萄球菌耐药率为79.0%,金黄色葡萄球菌耐药率为78.0%。结论多重PCR技术检测mecA基因能快速、敏感、准确地检测MRS,与femA基因联合检测能有效检测MRSA。MRS已成为日益严重的葡萄球菌感染问题。
  [关键词] 葡萄球菌感染;甲氧西林抗药性;聚合酶链反应
 
  [ABSTRACT]ObjectiveTo detect methicillin-resistant staphylococcus (MRS) by multiple PCR, and to investigate its drug resistance rate in our hospital. MethodsThe DNA fragments of 262 strains of staphylococcus (staphylococcus aureus, 86; co-agulase-negative staphylococcus, 176) were amplified by multiple PCR . The results were compared with Agar Dilution. The drug resistance rate was analyzed statistically. ResultsTaking mecA positive for MRS detection, the sensitivity,specificity,negative predictive values and positive predictive value were 100%,96.6%,100% and 99.0%, respectively; taking mecA positive and femA positive for methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) detection, the sensitivity,specificity,negative predictive values and positive predictive value were 100%,99.5%,100% and 98.5%,respectively. The drug resistance of staphylococcus in our hospital was 78.6%, in which, coagulase-negative staphylococcus accounting for 79.0%, and staphylococcus aureus, 78.0%. Conclu-sionThe detection of mecA gene by multiple PCR for MRS is sensitive,rapid and accurate. A combination of mecA and femA can effectively detect MRSA. MRS has become an increasingly serious problem in staphylococcus infection. 
  [KEY WORDS]staphylococcal infection; methicillin resistance; polymerase chain reaction
  自从1961年在英国发现首例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),MRSA和耐甲氧西林的凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)在世界上迅速蔓延,对β-内酰胺类抗生素的耐药性不断增强的葡萄球菌造成的感染已成为日益严重的临床问题。现已明确,大量产生的一种新的青霉素结合蛋白―― ―PBP2a是葡萄球菌对甲氧西林耐药的主要原因。mecA基因是PBP2a的编码基因,只存在于葡萄球菌中,因此,mecA基因可作为耐甲氧西林葡萄球菌的分子标志[1]。本文依据多重聚合酶链反应(PCR)的基本原理,并结合本实验室的具体特点在葡萄球菌的 16S rRNA基因内设计葡萄球菌的通用引物、耐甲氧西林葡萄球菌的mecA基因特异引物以及金黄色葡萄球菌(SA)的femA基因特异引物。采用多重PCR技术对标本进行快速检测,取得了较好的结果,现报告如下。
  1 材料和方法
  1.1 材料 
  1.1.1标本及其来源 金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)、大肠埃希菌标准株(ATCC25922)为本室保存;mecA基因阳性标准MRSA菌株(SA0129)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)标准菌株(SA0131)由美国Pfizer公司研究所提供。临床标本由青岛大学医学院第二附属医院检验科提 供,其中甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA) 33株,MRSA 53株,甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌(MSCNS)135株,MRCNS 41株。标本来源于创面分离物、引流液、痰、血、中段尿等送检标本。 
  1.1.2实验试剂与仪器 基因组DNA提取试剂盒购自美国Promega公司;PCR试剂(TaqDNA聚合酶、4×dNTPs、10×buffer等)购自加拿大MBI公司;DNA Marker DL2000购自大连Takara公司;利用DNAStar软件设计的引物由上海生工公司合成。API-Staph鉴定系统、鉴定用生化和药敏试剂及细菌培养瓶均为法国梅力埃公司产品。血液琼脂平板、革兰染色液等均为本室自行配制。4800型DNA扩增仪为美国PERKIN公司产品;Microscan全自动细菌鉴定仪为美国DaDe Behring公司生产。
  1.2 方法 
  1.2.1引物的设计 在GenBank中收集mecA、femA及葡萄球菌的16S rRNA基因序列,应用DNAStar Megaline软件进行分析,用Primer Prim-ier软件设计mecA、femA基因及葡萄球菌属的扩增引物。设计2条葡萄球菌的16S rRNA通用引物,P1:ACGTGTAAGTAACTGTGC,P2:TGCG-GTTGGATCCCCTCCTT,扩增产物约为1 088 bp片段;2条耐甲氧西林葡萄球菌mecA基因的引物,M1:TAGTTGTAGTTG-TCGGGT,M2:TATCG-GACGTTCAGTCAT,扩增产物约为165 bp片段;设计2条金黄色葡萄球菌femA基因的引物,F1:ACAGTCATTTCACGCAAAC,F2:ACCTGTA-ATCTCGCCATC,扩增产物约为314 bp片段。 
  1.2.2细菌DNA的提取 按美国Promega公司生产的基因组DNA提取试剂盒(Wizard Genomic DNA Purification Kit)操作说明书操作。 
  1.2.3目的基因的PCR扩增 取上述提取的MSSA、MRSA、MRNCS及大肠埃希菌标准株(ATCC25922)对照菌株的DNA各1 μL作为扩增的模板,加入PCR反应体系,引物、MgCl2 、dNTPs终浓度分别为2 μmol/L、250 μmol/L、250 nmol/L,1×PCR buffer,6×105 U/L Taq酶,反应总体积 25 μL 。PCR反应参数:94 ℃预变性6 min;94 ℃ 60 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35个循环;72 ℃延伸 10 min 。扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳后,在紫外线灯下观察结果。 
  1.2.4 多重PCR扩增敏感性测定 将金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)接种于LB培养液中, 37 ℃ 摇床振荡培养至对数生长期,用ddH 2 O作系 列1∶10稀释,每一稀释度各吸取1 mL,倾注适量56 ℃的营养琼脂,37 ℃过夜后计数菌落形成单位(CFU);同时,菌株的每一稀释度均按1.2.2方法提取DNA后,用三套引物进行多重PCR扩增,检测能产生特异性产物的最低稀释浓度。 
  1.2.5临床标本的常规细菌学检测 用常规细菌的琼脂稀释法药物敏感试验鉴定MRS,结果判断参照美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的判断标准。苯唑西林的最小抑菌浓度(MIC)≤ 8 mg・ L -1为敏感,816 mg・L-1为耐药。
  2 结果
  2.1 多重PCR扩增的敏感性 将金黄色葡萄球菌标准株作1∶10系列稀释后分别进行PCR扩增,结果显示最低可检测出8×103CFU/L的金黄色葡萄球菌。
  2.2 部分菌株多重PCR扩增结果 用3对引物P1、P2、M1、M2、F1、F2对金黄色葡萄球菌、MRSA、MRCNS进行多重PCR扩增,均有1 088 bp条带产生,同时MRSA有165 bp、 314 bp 两条带产生,MRCNS有165 bp条带产生,金黄色葡萄球菌有314 bp条带产生,大肠埃希菌无任何带产生。见图1。
  图1 MRS mecA基因、femA基因、16S rRNA多重PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(略)
  M为DL2000 DNA Marker;① MRSE标准株(SA0131);②耐甲氧西林溶血葡萄球菌;③耐甲氧西林表皮葡萄球菌;④耐甲氧西林腐生葡萄球菌;⑤金黄色葡萄球菌标准株(ATCC29213);⑥、⑦甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌;⑧MRSA标准株(SA0129);⑨甲氧西林敏感表皮葡萄球菌;⑩对照菌株(大肠埃希菌标准株ATCC25922)
  2.3262株葡萄球菌多重PCR扩增结果 以琼脂稀释法为金标准,将262株葡萄球菌分为MRSA、MSSA、MRCNS、MSCNS,多重PCR扩增有4种模式,见表1。100%的MRSA含mecA基因和femA基因,仅5%的MSSA含mecA基因和femA基因。mecA基因在MRCNS、MSCNS中的 检出率分别为 100%、2.6%。100% 的金黄色葡萄球菌含femA基因,而femA基因在凝固酶阴性葡萄球菌中未被检出。
  2.4 多重PCR扩增与琼脂稀释法的比较 
  2.4.1以mecA基因阳性判断MRS 262株葡萄球菌中若以mecA基因阳性作为判断MRS的指标,与琼脂稀释法比较,多重PCR的灵敏度为100%,特异度为96.6%,阳性预测值为100%,阴性预测值为99.0%。见表2。 
  2.4.2以mecA和femA基因阳性判断MRSA 262株 葡萄球菌中若以mecA基因和femA基因阳性作为判断MRSA的指标,与琼脂稀释法比较,多重PCR的灵敏度为100%,特异度为99.5%,阳性预测值为100%,阴性预测值为98.5%。见表3。

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