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大鼠胸主动脉球囊损伤后早期平滑肌细胞凋亡观察

2017-11-08 03:00:12    作者:admin    www.5alw.com

【摘要】  目的 探讨大鼠胸主动脉球囊损伤后早期细胞凋亡和凋亡相关基因表达的变化及其规律。方法 将36只雄性SD大鼠随机分为两组,手术组(n=30)行球囊扩张损伤大鼠胸主动脉术;对照组(n=6)不行球囊损伤。取正常及损伤术后即刻、30 min、1 h、2 h、4 h胸主动脉,应用苏木精?伊红染色、TUNEL法、免疫组化和计算机图像分析等方法进行形态学观察,进行细胞凋亡、凋亡基因Fas、抗凋亡基因Bcl?2表达水平检测。结果 正常大鼠胸主动脉管腔面有单层完整内皮细胞,内外弹力层呈波浪形,完整连续;手术组球囊损伤后可见内弹力层模糊,多处断裂,管腔面毛糙无内皮细胞;损伤后4 h中膜平滑肌细胞密度较对照组减少。对照组、手术组损伤后即刻胸主动脉偶见凋亡细胞;手术组球囊损伤后30 min,管壁中膜可见大量凋亡平滑肌细胞,损伤后 1、2 h 中膜凋亡细胞明显减少,损伤后4 h中膜仅偶见凋亡细胞。对照组、手术组动脉损伤后即刻胸主动脉偶见Fas阳性平滑肌细胞,球囊损伤后30 min中膜可见大量Fas阳性细胞,损伤后 1、2 h中膜Fas阳性细胞明显减少,动脉损伤后4 h仅偶见Fas阳性平滑肌细胞。对照组动脉壁显著表达Bcl?2,手术组胸主动脉中膜Bcl?2表达迅速下降,损伤后1 h达最低水平,后回升。Bcl?2与Fas表达呈负相关(r=-0.816,P<0.01)。结论 平滑肌细胞凋亡可能在动脉损伤后平滑肌细胞过度增殖和迁移过程中具有重要作用。 
【关键词】  肌细胞 平滑肌 血管 凋亡 Fas Bcl?2 球囊损伤 大鼠
[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the early changes of apoptosis and the expression of Fas/Bcl?2 in rat aorta after balloon withdrawal injury.MethodsThirty?six SD rats were randomly divided into two groups: operation group (n=30)  and control group (n=6). The rats in operation group had balloon induced endothelium denudation in thoracic aorta and were killed at the time of balloon injury and 0.5, 1, 2, and 4 hours later. Using TUNEL labeling, immunohistochemistry, and computerized image analysis to observe the aorta for smooth muscle cell apoptosis, the expression of Fas/Bcl?2 and the morphology.ResultsThe surface of vessel lumen of normal rat aorta had a monolayer of integrated endothelial cells. The internal elastic lamina was ruptured after the injury, and no endothelial cells were found. The density of vascular smooth muscle cells was reduced obviously 4 hours later. Few apoptotic cells were detected in the uninjured control vessels and in vessels immediately after injury.  Remarkable medial vascular smooth muscle cells appeared apoptotic at 30 min, and then significantly reduced at 1 or 2 hours,  and were occasionally seen 4 hours later. In normal rat arteries, Bcl?2 was detected after balloon injury, its expression in media reached the lowest level at 1 hour and then upregulated. The expression of Fas and Bcl?2 showed remarkably negative correlation (r=-0.816,P<0.01).ConclusionThe changes of apoptosis of smooth muscle cells probably play an important role in the process of excessive proliferation and transfer of the muscle cells after artery injury.
    [KEY WORDS]myocyte, smooth muscle; blood vessels; apoptosis; Fas; Bcl?2; balloon injury
    目前支架介入治疗已成为冠心病治疗中积极有效的办法,其在挽救急性冠状动脉综合征病人生命及改善冠心病病人长期生活质量方面的作用已得到充分肯定。但术后再狭窄(RS)大大影响了经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)及支架置入术后远期疗效。研究表明,PTCA后血管平滑肌细胞(VSMC)的过度增殖和迁移在新生内膜过度增生、血管重塑和再狭窄的病理过程中起关键作用。人们围绕平滑肌细胞增殖做了大量基础及临床研究,但再狭窄仍然是困扰心血管介入医生的一大难题[1]。血管平滑肌的凋亡在许多心血管疾病中具有重要意义[2],但动脉损伤后细胞凋亡的变化规律及其在再狭窄过程中的意义有待进一步阐明。本实验旨在研究大鼠胸主动脉球囊损伤后早期细胞凋亡规律,为再狭窄的防治提供可能的途径和理论依据。
    1  资料与方法
    1.1  动物分组及处理 
    选用体质量400~500 g的雄性SD大鼠36只(购于北京医科大学动物中心),随机分为两组。对照组(n=6)不行球囊损伤,作为正常对照。手术组(n=30)行球囊损伤胸主动脉术,按术后处死时间又分为术后即刻、30 min、1 h、2 h、4 h等不同亚组,每组6只。
    1.2  大鼠胸主动脉球囊损伤模型及标本制作
    手术组参照文献[3]建立方法用戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,经左侧颈总动脉插入2F球囊导管,仔细操作导管越过主动脉弓进入胸腹主动脉远端(即肾动脉分叉处),注入生理盐水0.15~0.20 mL回拉至主动脉弓颈总动脉开口处,重复6次并旋转方向以充分剥脱内皮, 损伤胸主动脉,之后取出导管,缝合切口。为证实手术成功,参照文献[3],取3只大鼠,术后即刻从大鼠左颈静脉注入5 g/L Evan蓝(3 mL/kg),1 h后处死动物,观察内皮剥脱情况,并制作术后即刻主动脉苏木精?伊红染色切片,证明主动脉内皮剥脱完全,管壁弹力层可见部分断裂。分别在术后即刻、30 min、1 h、2 h、4 h,麻醉大鼠后开胸暴露主动脉,取横膈上1~2 cm 处血管段,投入40 g/L中性缓冲甲醛溶液中固定24 h,然后脱水,透明,石蜡包埋,切片(4 μm)。
    1.3  形态学观察
    组织切片经苏木精?伊红染色,光学显微镜下观察正常及球囊损伤后主动脉管壁形态学改变,并用VIDAS图像分析仪(德国)计数中膜平滑肌细胞数目,计算单位面积平滑肌细胞密度。
    1.4  凋亡细胞测定
    应用TUNEL凋亡试剂盒(北京中山生物技术公司)检测,按试剂盒说明书操作,细胞中出现棕黄色染色者为凋亡阳性细胞,VIDAS图像分析仪(德国)测定阳性细胞数,计算细胞凋亡率。
    1.5  凋亡基因表达的检测
    应用免疫组化SP法测定正常及球囊损伤后主动脉管壁中凋亡基因Fas和抗凋亡基因Bcl?2的表达,SP试剂盒购于北京中山生物技术公司,按试剂盒说明书操作。Fas阳性表达定位于细胞胞膜和胞浆,呈黄至棕黄色,Bcl?2阳性表达定位于胞浆。用VIDAS图像分析仪(德国)随机测量每张切片6个视野中阳性细胞的百分率、平均吸光度(A)值,取其均数,用两者乘积再乘以100作为阳性表达指数表示Fas、Bcl?2的表达水平。
    1.6  统计学分析
    用SPSS 11.0软件进行相关的统计学处理,结果用±s表示,数据间比较采用t检验,相关分析采用直线相关分析。
    2  结    果
    2.1  胸主动脉损伤后血管形态学变化
    对照组管壁腔面有单层完整内皮细胞,内外弹力层呈波浪形,完整连续。手术组术后即刻可见内弹力层模糊,多处断裂,管腔面毛糙无内皮细胞;术后30 min、1 h、2 h 无新生内皮细胞,中膜无增殖现象;术后4 h仍无新生内皮细胞,中膜平滑肌细胞密度为(202±21)/mm2,对照组为(240±26)/mm2,差异有显著性(t=3.533,P<0.05)。
    2.2  胸主动脉损伤后管壁平滑肌细胞凋亡情况
    对照组管壁平滑肌细胞偶见凋亡细胞, 细胞凋亡率为(1.5±0.4)%;手术组术后30 min管壁中膜可见大量凋亡平滑肌细胞,多集中于管腔面,细胞凋亡率为(68.3±6.2)%;术后 1、2 h 中膜凋亡细胞明显减少,细胞凋亡率分别为(50.5±7.1)%、(7.7±2.9)%;术后即刻及术后4 h中膜仅偶见凋亡细胞,细胞凋亡率分别为(1.7±0.5)%、(1.7±0.3)%。术后即刻、30 min、1 h、2 h、4 h细胞凋亡率间比较,差异有显著性(t=3.542~12.378,P<0.05);对照组及手术组术后即刻、术后4 h细胞凋亡率间比较,差异无显著性(t=2.274,P>0.05)。
    2.3  胸主动脉损伤后凋亡基因Fas的表达
    术后30 min、1 h、2 h中膜平滑肌细胞Fas阳性表达指数分别为18.23±3.78、11.38±2.86、3.36±1.08,而对照组、手术组术后即刻、4 h偶见Fas阳性细胞,阳性表达指数分别为0.73±0.25、0.69±0.18、0.83±0.21。术后即刻、30 min、1 h、2 h、4 h阳性表达指数间比较,差异有显著性(t=3.586~11.975,P<0.05);对照组、术后即刻、术后4 h细胞凋亡率比较,差异无显著性(t=1.976,P>0.05)。
    2.4  胸主动脉损伤后抗凋亡基因Bcl?2表达变化
    正常动脉中膜Bcl?2显著表达,Bcl?2阳性表达指数为28.23±4.67;动脉损伤后抗凋亡基因Bcl?2表达下调,术后即刻、30 min阳性表达指数分别为 25.20±3.76、12.26±3.05;术后1 h达最低水平,阳性表达指数为4.26±1.28;术后2、4 h表达回升,阳性表达指数分别为10.27±2.75、16.35±3.25。术后即刻、30 min、1 h、2 h、4 h Bcl?2阳性表达指数间比较,差异均有显著性(t=3.238~12.021,P<0.05);对照组、手术组术后即刻Bcl?2阳性表达指数间差异无显著意义(t=2.221,P>0.05);Bcl?2表达与凋亡基因Fas表达呈负相关(r=-0.816,P<0.01)。

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