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孕妇外周血中胎儿DNA及瘦素含量与子痫前期发病的关系

2017-11-08 14:02:04    作者:admin    www.5alw.com

                      作者:于进 陶红 纪向虹 王雪梅 

【摘要】  目的 探讨孕妇外周血中胎儿DNA及瘦素含量与子痫前期发病的关系。方法 选择30例子痫前期孕妇为子痫前期组(其中轻度18例,重度12例),B超确定所妊娠的胎儿为男性,于孕20周前、发病时、分娩后6 h 抽取外周血;另选30例正常孕妇为对照组,B超确定所妊娠的胎儿为男性,对应子痫前期组时间取血液标本。采用荧光定量PCR及放射免疫方法检测孕妇外周血胎儿DNA浓度及瘦素水平。结果 孕20周及发病时胎儿DNA浓度,轻度子痫前期较对照组明显升高,重度子痫前期较轻度者明显升高(F=84.80、96.79,q=11.37~17.30,P<0.05);分娩后6 h胎儿DNA浓度,子痫前期组较对照组明显升高(t′=18.65,P<0.05)。子痫前期发病时瘦素值,轻度子痫前期较对照组明显升高,重度子痫前期较轻度子痫前期明显升高(F=26.46,q=19.23、21.24,P<0.05)。子痫前期病人血液中胎儿DNA与瘦素水平呈正相关关系(r=0.997,P<0.05 )。结论 孕妇外周血胎儿DNA及瘦素水平与子痫前期发病具有相关性。 
【关键词】  子痫 DNA 瘦素

[ABSTRACT]ObjectiveTo study the concentration of fetal DNA and leptin in maternal blood and their relationship with preeclampsia. MethodsThirty gravida with preeclampsia, mild 18 and severe 12, were enrolled in this study. The blood was taken at around 20 weeks of gestation, at the onset, and six hours after parturition. And 30 normal gravida served as controls, their blood was taken accordingly. All of this two groups were confirmed ultrasonographically to have a male fetus.   Fetal  DNA  and leptin in all the pregnant women plasma were measured by fluorescent quantitative polymerase chain reaction (FQ?PCR) and radioimmunoassay (RIA). ResultsThe fetal DNA level of the mild patients at about 20?week gestation and at onset was remarkably higher than that the normal control, and that of the severe ones was higher than that of the mild ones (F=84.80,96.79;q=11.37-17.30;P<0.05). At six hours after dilivery, the fetal DNA level of the patients was significantly higher than that of the control group (t′=18.65,P<0.05). During the attack of preeclampsia, the leptin concentration was significantly higher than that of the normal control, and that of the severe cases was higher than that of the mild ones (F=26.46’q=19.23,21.24;P<0.05). A positive correlativity was observed between the fetal DNA and leptin concentration in the patients (r=0.997, P<0.05 ).ConclusionThe concentration of fetal DNA and leptin in maternal blood closely correlates with preeclampsia.
    [KEY WORDS]eclampsia; DNA; leptin
    妊娠高血压综合症是妊娠期特有疾病,但其病因至今尚未明确,而且对它的预测没有明确的指标。子痫前期的主要病理学因素可能是由于滋养层不能有效地侵入蜕膜和动脉管壁,导致胎盘缺陷,着床较浅,致滋养细胞缺血低氧[1]。而有研究证明胎盘低氧是胎盘瘦素合成增加的重要因素之一[2],因此子痫前期孕妇外周血中瘦素水平可能增加。同时有研究发现,子痫前期由于胎母界面的滋养层细胞受到低氧的损害及母体免疫损伤,胎盘滋养细胞凋亡增加而引起更多的胎儿游离DNA释放入血[3,4]。另一方面,负责清除母体血循环中胎儿DNA的主要器官肝、肾等功能受损而清除减少[5],故有学者认为子痫前期母血循环中胎儿DNA会有异常增高。本研究旨在通过测定子痫前期病人发病前、发病时、分娩后外周血中胎儿游离DNA及瘦素水平,探讨胎儿DNA及瘦素含量与子痫前期发病的相关性。
    1  对象与方法
    1.1  对象  
    2003年9月~2004年9月,本院行围生期检查的初次妊娠孕妇1 963例,均于妊娠20周左右进行平均动脉压测定,其中平均动脉压≥11.3 kPa者338例,跟踪后发现有66例发展成为子痫前期, 子痫前期的诊断符合文献[1]标准。选择B超确定所妊娠胎儿为男性的孕妇30例为子痫前期组,其中轻度子痫前期18例,重度子痫前期12例;年龄25~35岁,平均28.3岁;分娩孕周27~41周,平均32周。另选择B超确定所妊娠胎儿为男性的初次妊娠正常孕妇30例作为对照组,年龄25~36岁,平均27.8 岁;分娩孕周28~40周,平均32周。两组分娩孕周、年龄差异无显著性。
    1.2  方法
    1.2.1  样本的准备  在妊娠20周时、发病时、分娩后6 h,分别用抗凝管抽取孕妇外周血各3 mL,3 000 r/min 离心10 min,吸取血浆置于灭菌的离心小管中,于-80 ℃保存待检。对照组于子痫前期组相同时间抽取血标本。
    1.2.2  胎儿DNA提取  采用德国Qiagen公司提供的DNA提取试剂盒,按说明逐步操作。
    1.2.3  SRY基因的PCR引物  使用Y染色体上SRY位点对男性胎儿DNA进行定量,片段大小为139 bp,上游引物:5′?CGAAGATGCCGAAGAAT?3′; 下游引物:5′?GGCGGTAAGTGGCCTAGCT?3′。
    1.2.4  荧光定量?PCR检测  用iCycler?IQ荧光定量PCR仪检测。探针为5′?(FAM)CAGTTTCCCGCAGATCCCG(TAMRA)?3′。 PCR试剂盒由中山大学达安公司提供。PCR扩增条件:5×定量PCR buffer 10 μL、上游引物F 1 μL、下游引物R 1 μL、dNTP 1 μL、荧光探针1 μL、Tag酶1 μL、DNA模板5 μL、ddH2O 30 μL,总体积50 μL。 PCR 循环条件为:93 ℃预变性2 min,93 ℃变性45 s,60 ℃退火60 s,10个循环后,93 ℃变性30 s,60 ℃退火45 s,30个循环。用已知浓度的男性基因组DNA作为标准曲线,推算出所测样本的浓度,即每毫升样本中的拷贝数。
    1.2.5  瘦素的检测  瘦素测定采用放射免疫法,操作按照试剂盒说明书,所用仪器为中国科技大学开发研究院提供的GC?911全自动γ计数器。
    1.2.6  统计学处理  数据均采用SPSS 10.0系统软件进行处理。应用方差分析进行比较,数据分布不符合方差齐性的要求,用t′检验进行比较。
    2  结    果
  2.1  两组孕妇不同时期外周血中胎儿游离DNA水平的变化 
    孕20周及发病时胎儿DNA浓度,轻度子痫前期组较对照组、重度子痫前期组较轻度子痫前期组明显升高(F=84.80、96.79,q=11.37~17.30,P<0.05);分娩后6 h胎儿DNA浓度,子痫前期组较对照组明显升高(t′=18.65,P<0.05)。见表1。
    2.2  子痫前期病人外周血瘦素水平与正常孕妇的比较
    子痫前期发病时外周血瘦素值,轻度子痫前期组较对照组明显升高,重度子痫前期组较轻度子痫前期组明显升高(F=26.46,q=19.23、21.24,P<0.05)。见表1。表1  子痫前期组病人血中胎儿游离DNA及瘦素浓度与正常孕妇的比较
    2.3  子痫前期病人外周血胎儿游离DNA浓度与瘦素的相关性
    子痫前期病人发病时外周血中胎儿游离DNA与瘦素浓度呈正相关关系(r=0.997, P<0.05 )。
    3  讨    论
    3.1  外周血胎儿游离DNA与子痫前期的关系 
    1979年,HERZENBERG利用流式细胞仪在母体外周血中检测到胎儿细胞,并利用其进行产前诊断。后又有学者利用免疫磁珠细胞分离系统和三度梯度离心技术检测母血胎儿细胞,但由于母血中胎儿细胞少、分离纯度不高、实验难度大及费用昂贵等因素,故未能在临床推广。而有学者认为,在免疫学上胚胎对于母体类似于肿瘤对于机体,将胎盘的部分行为称为伪恶性,那么在母血中就可能存在胎儿DNA。1997年,LO等[6]首次证明孕妇外周血中存在胎儿游离DNA。
    目前认为孕妇外周血胎儿游离DNA存在有以下几种可能的机制。①胎儿有核细胞通过胎盘屏障渗透到母体血液中,被母体的免疫系统识别为异物,并受到免疫攻击,致使细胞核膜溶解,DNA 释放入母血循环中[6]。②胎儿组织在发育过程中自然凋亡,释放出的DNA经母体?胎儿界面进入母血循环中。有证据表明循环胎儿DNA具有凋亡DNA片段的一些特征,胎盘的细胞凋亡已经得到证实[7]。③胎儿DNA直接从胎儿组织中释放,经母体?胎儿界面进入母血中[8]。
    近年来,许多学者对孕妇外周血胎儿DNA进行了研究,发现子痫前期病人外周血胎儿DNA含量明显高于同时期的正常妊娠妇女[3,9,10],而且子痫前期孕妇在有临床症状和体征之前,外周血胎儿DNA含量已经出现异常增高[11]。本文研究结果也显示,在妊娠20周和发病时, 轻度子痫前期病人外周血胎儿DNA含量均较对照组明显升高,重度子痫前期病人均较轻度者明显升高。说明子痫前期病人,在出现临床症状和体征之前,外周血中胎儿DNA含量已经出现变化,而且随着病情的加重而增加。因此,外周血胎儿游离DNA 含量的变化,对子痫前期的预测和诊断具有临床应用价值。
    胎儿游离DNA在子痫前期孕妇体内增加的现象,可以使人们对子痫前期的发病机制有更深刻的理解,由于胎母界面的滋养层细胞受到母体免疫损伤,胎盘滋养细胞凋亡增加而引起更多的胎儿游离DNA释放入血[3,12],是胎盘发生异常改变的标志,因此认为,胎盘异常很可能导致较多胎儿DNA释放到母血中。而子痫前期孕妇肝、肾功能异常导致胎儿DNA在母血中清除紊乱,也可造成母血中胎儿DNA的量增多。因此,母体外周血中游离胎儿DNA浓度可以用来预测子痫前期的发生及预后。

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