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caspase3抑制剂对肾缺血再灌注损伤的保护作用

2017-11-10 04:00:10    作者:admin    www.5alw.com

                     作者:王占坤 孙立江 李旭东

【摘要】    目的 观察caspase?3抑制剂对缺血再灌注损伤肾脏的保护作用,并探讨其作用机制。方法 建立小鼠肾缺血再灌注模型,将实验动物随机分为3组:假手术组、缺血再灌注组、治疗组(各10只)。治疗组小鼠给予Ac?DEVD?CHO (4 μg/g)0.3 mL,缺血再灌注组再灌注时给予0.3 mL含体积分数0.01 DMSO的生理盐水,假手术组不夹闭肾蒂,余处理同缺血再灌注组。分别检测各组血肌酐(Cr)含量、尿素氮(BUN)含量、细胞凋亡指数(AI)、caspase?3活性、髓过氧化物酶(MPO)活性、黏附分子?1(ICAM?1)表达指数。结果 治疗组与缺血再灌注组比较,血Cr和BUN均明显降低,caspase?3活性受到明显抑制,AI明显下降,MPO活性显著降低,ICAM?1表达明显减少,差异均有显著性(F=36.10~574.13,P<0.05)。结论 Ac?DEVD?CHO通过抑制细胞凋亡及炎症反应减轻肾脏缺血再灌注损伤。 
【关键词】  肾 再灌注损伤 半胱氨酸内肽酶类 细胞凋亡
  [ABSTRACT] Objective To study the protection and its mechanisms of caspase?3 inhibitor on renal ischemia?reperfusion injury. Methods A renal ischemia?reperfusion model was made in 30 rats, which were evenly divided into three groups, i.e. sham?operation group (S?O group), ischemia?reperfusion (I?R group), and Ac?DEVD?CHO group (treated group). Ac?DEVD?CHO was given to treated group; normal saline, 0.3 mL, to I?R group while reperfusion being done; for S?O group, no renal pedicles were clamped. The myeloperoxidase (MPO) and caspase?3 activity, blood urea nitrogen(BUN) and creatinine (Cr), renal cell apoptosis index (AI), expression of intercellular adhesion molecule?1 (ICAM?1) in each group were detected. Results A comparison between treated group and I?R group showed that for treated group, the levels of Cr and BUN were both decreased, the activity of caspase?3 and MPO were inhibited, the AI decreased, and the index of ICAM?1 expression decreased (F=36.10-574.13,P<0.05). The differences of the above items were of statistically significant. Conclusion caspase?3 inhibitor Ac?DEVD?CHO lessens reperfusion injury of the kidney via inhibition of cell apoptosis and inflammatory reaction.
    
  [KEY WORDS] Kidney; Reperfusion injury; Cysteine endopeptidases; Apoptosis
    
  急性肾脏缺血?再灌注(I/R)损伤是休克、严重创伤及肾移植过程中一种常见的临床病理生理现象,可以导致急性肾衰竭(ARF)和移植肾功能丧失。因此,如何保护肾脏免受I/R损伤,具有重要的临床意义。肾I/R损伤机制复杂,有研究表明,细胞凋亡在这一过程中起重要作用[1]。天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(caspase)是参与调节和执行细胞凋亡最重要的蛋白酶类[2],其中caspase?3是各种凋亡通路的必经之路,在细胞凋亡中起关键性作用[3]。徐强等[4]研究结果证实,应用caspase?3抑制剂(Ac?DEVD?CHO)不仅能抑制I/R心肌细胞凋亡而且减少了炎症反应,对损伤的心肌起到保护作用。但其是否对I/R肾脏有相似作用尚未见报道。本实验通过建立小鼠肾脏I/R模型,观察caspase?3抑制剂对I/R损伤肾脏的保护作用并探讨其作用机制。
  1  材料与方法
  1.1  试剂
    
  Ac?DEVD?CHO(Promega公司,用前将其溶于3 μL DMSO中,后用生理盐水稀释成0.3 mL),尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)检测试剂盒(南京建成公司),TUNEL试剂盒(Roche公司),caspase?3检测试剂盒(Promega公司),髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒(南京建成公司),PowerVisionTM免疫组化检测试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。
  1.2  动物及分组
    
  健康雄性昆明小鼠30只,体质量20~25 g(购自青岛市动物中心)。随机分为3组:假手术组、缺血再灌注组、治疗组,各10只。
  1.3  实验方法
  1.3.1  动物模型的制备  参照李广宇等[5]所介绍方法,用35 g/L水合氯醛0.01 mL/g腹腔注射麻醉小鼠后,沿腹正中纵轴线做0.8~1.0 cm的切口,首先切除右肾,然后钝性分离左肾包膜,用无创动脉夹钳夹左肾蒂45 min,造成肾缺血,然后松开血管夹,数分钟内肾脏颜色由缺血时的紫黑色转为红色,表示肾缺血再灌注模型建立成功。分二层关闭切口。为维持小鼠体液平衡,用1 mL预热的(37 ℃)生理盐水皮下注射。在再灌注后12 h处死小鼠,摘眼球采血,切取左肾备用。
  1.3.2  用药方法  治疗组小鼠给予Ac?DEVD?CHO,4 μg/g;缺血再灌注组再灌注时予0.3 mL含体积分数0.01 DMSO的生理盐水;假手术组不夹闭肾蒂,余处理同缺血再灌注组。
  1.4  检测指标及方法
  1.4.1  血BUN和Cr含量的测定  于再灌注12 h后摘眼球取血约1 mL,用酶法和苦味酸法分别检测BUN及Cr值。
  1.4.2  细胞凋亡率测定  制作肾脏石蜡切片,常规二甲苯脱蜡,采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的原位末端标记法(TUNEL)测定细胞凋亡率,按检测试剂盒说明书操作。光镜下观察,细胞核呈棕黄色者为凋亡细胞,于凋亡细胞分布区域,随机选取5个视野,400倍光镜下计数凋亡细胞,以肾小管上皮细胞凋亡阳性细胞数占总肾小管上皮细胞细胞数的百分比作为肾小管上皮细胞凋亡指数(AI)。AI(%)=阳性细胞数/视野所有细胞总数×100%。
  1.4.3  肾组织caspase?3活性测定  用预冷的组织裂解液(含有25 mmol/L Hepes、5 mmol/L MgCl2、2 mmol/L DTT、5 mmol/L EDTA、体积分数0.001 Triton X?100)裂解新鲜肾组织。4 ℃ 13 000 r/min离心20 min,取上清,比色法测定caspase?3活性,按试剂盒(CaspACETM Assay System,Colorimetric,Promega)说明书操作。酶标仪测405 nm处吸光度(A)值,计算caspase?3活性。
  1.4.4  MPO测定  在生理盐水冰盘上迅速取部分左肾组织,按质量体积比加入9倍的预冷生理盐水,制成10%组织匀浆,普通离心机(3 500 r/min)离心 15 min,取上清液置于-70 ℃冰箱。待标本收集齐后,按MPO试剂盒说明测定MPO活性。
  1.4.5  肾组织中ICAM?1检测  应用免疫组化方法,操作按ICAM?1试剂盒说明书进行。镜下观察,胞浆ICAM?1阳性染色为棕黄色,采用医学图像分析软件(PIXERA,美国)进行分析。每例切片随机取10个肾小球视野,光学显微镜采集图像。输入图像分析系统内进行吸光度(A)测量,同时计算阳性着色面积,计算阳性指数,取平均值。阳性指数=阳性信号面积×阳性强度(平均灰度值)/肾小球面积。
  1.5  统计学处理
    
  各组实验数据用±s表示。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,其中多个样本均数间比较采用完全随机设计的单因素方差分析,两两比较采用LSD检验。
  2  结果
 
  2.1  caspase?3抑制剂对I/R损伤肾脏功能的影响
    
  肾脏功能指标Cr、BUN值3组间差异均有显著性(F=574.13、303.95,P<0.01);缺血再灌注组较假手术组均明显升高(P<0.01),说明小鼠肾脏I/R模型制备成功;治疗组与缺血再灌注组比较,Cr、BUN值均明显降低,差异有显著性(P<0.01)。见表1。
    
  表1  各组小鼠相关检测指标比较(略)
  各检测指标多组间比较,F=36.10~574.13,P<0.01;与假手术组相比,*P<0.05,**P<0.01;与缺血再灌注组相比,#P<0.05,##P<0.01
  2.2  caspase?3抑制剂对I/R损伤肾脏细胞凋亡的影响
    
  假手术组肾脏组织只有极少数细胞发生凋亡,而缺血再灌注组细胞凋亡明显增多,治疗组与缺血再灌注组比较,细胞凋亡数减少,但仍多于假手术组。肾细胞AI各组间相比较,差异有显著意义(F=312.29,P<0.01),其中缺血再灌注组较假手术组明显升高(P<0.01);治疗组与缺血再灌注组比较,凋亡指数明显降低(P<0.01)。见表1。
  2.3  Ac?DEVD?CHO对I/R损伤肾脏组织caspase?3活性的影响
    
  肾组织caspase?3活性3组间差异具有显著性(F=146.20,P<0.01);缺血再灌注组较假手术组明显增强(P<0.01);治疗组与缺血再灌注组比较,caspase?3活性明显降低(P<0.01);治疗组与假手术组比较,caspase?3活性差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
  2.4  caspase?3抑制剂对I/R损伤肾脏炎症反应的影响
    
  假手术组肾组织ICAM?1蛋白阳性表达甚微,而在缺血再灌注组的肾小球、肾小管、肾小血管均有不程度的ICAM?1蛋白阳性表达,且以肾小球表达为主,治疗组与缺血再灌注组比较,ICAM?1蛋白阳性表达减少。炎症相关指标MPO活性、ICAM?1阳性指数3组间差异均有显著性(F=66.21、36.10,P<0.01);缺血再灌注组与假手术组比较,炎症相关指标均明显升高(P<0.05);治疗组与缺血再灌注组比较,炎症相关指标均明显降低(P<0.05)。见表1。

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