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溴氰菊酯致大鼠慢性中毒的肝组织形态学观察

2017-11-11 14:00:08    作者:admin    www.5alw.com

                      作者:马晓梅 吴梅 李杰 陈宗慧 石微 杜卫

 

【摘要】  目的 探讨溴氰菊酯对大鼠肝组织结构的慢性损伤作用。方法 选取大鼠32只,随机分为空白对照组(Ⅰ组)、橄榄油对照组(Ⅱ组)、溴氰菊酯1.56 mg/kg组(Ⅲ组)、溴氰菊酯6.25 mg/kg组(Ⅳ组),每组8只。Ⅲ、Ⅳ组连续6个月经口灌胃染毒, Ⅱ组只给予相当剂量的橄榄油,观察大鼠染毒期间行为学变化,测定肝脏器系数,肝组织切片经苏木精?伊红染色和PAS染色,观察肝细胞形态学变化和肝细胞糖原含量的变化。结果 染毒组大鼠出现流涎、大汗、立毛等中毒症状。苏木精?伊红染色显示Ⅲ、Ⅳ组肝细胞胞浆疏松,内可见脂滴,肝血窦淤血。染毒组大鼠肝细胞的糖原含量有不同程度降低,Ⅳ组与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组相比,Ⅲ组和Ⅰ组相比差异有统计学意义(F=9.015,q=3.675~10.058,P<0.05);但Ⅲ组与Ⅱ组比较,差异无统计学意义(q=0.672,P>0.05)。Ⅲ、Ⅳ组肝脏器系数与其他各组比较,差异均有统计学意义(F=10.737,q=3.945~9.968,P<0.05)。结论 长期低剂量摄入溴氰菊酯可造成大鼠肝组织的慢性损伤,并具有剂量?效应关系。

【关键词】  溴氰菊酯;肝;免疫组织化学;糖原;大鼠

[ABSTRACT] Objective To study the chronic injury effects of deltamethrin (DM) on rat hepatic tissue. Methods Thirty?two Wistsar rats were evenly randomized to four groups. Group 1, served as blank control; group 2, olive oil was given; group 3, 1.56 mg/kg DM; and group 4, 6.25 mg/kg DM. Rats in groups 3 and 4 were given DM through lavage for 6 months, and those in group 2, corresponding dose of olive oil, their behavior was observed during DM administration. Organ coefficient of liver was recorded. Histological changes of liver and the content of glycogen in hepatic cells were examined with HE staining and PAS staining. Results Toxic symptoms such as drivel, hidrosis, piloerection were observed in rats with DM administration. Lipid droplets within pale watery cytoplasm of hepatocytes and hepatic sinusoid congestion were found in rats of groups 3 and 4. Hepatocytic glycogen content was variously reduced, the differences were significant as compared between group 4 and groups 1, 2, and 3, respectively, or between groups 3 and 4 (F=9.015;q=3.675-10.058;P<0.05). But there was no significant difference in hepatocytic glycogen content between groups 3 and 2 (q=0.672,P>0.05). The organ coefficient of liver in groups 3 and 4 was significantly different from those in the other groups (F=10.737;q=3.945-9.968;P<0.05). Conclusion Long?term intake of low?dose deltamethrin may cause chronic injury of hepatic tissue in rats with a dose?effect relation.

  [KEY WORDS] deltamethrin; liver; immunohistochemistry; glycogen; rats

  溴氰菊酯商品名敌杀死, 是一种含有α?氰基Ⅱ型拟除虫菊酯类农药,其分子式为C12H19Br2NO3,性质较稳定,具有广谱、高效、低残留以及在哺乳动物体内转化迅速的特点, 已广泛用于农业害虫、仓储害虫和卫生害虫的防治。近年来,随溴氰菊酯应用的日益广泛,除了其急性毒性的研究外,已有报道溴氰菊酯可能有蓄积毒性的特点,长期接触可能引起慢性疾病,但主要局限于神经毒性作用方面的研究[1?7]。本实验旨在通过观察大鼠慢性溴氰菊酯中毒的肝脏病理改变,积累病理学方面的资料,为慢性中毒的诊断、治疗提供科学的理论依据。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 主要试剂与仪器 溴氰菊酯原粉(纯度为98%),购自南京红太阳试剂公司;高碘酸、苏木精购自青岛爱普科生物工程有限公司。德国SLEECUT 5062型石蜡切片机,德国SLEEMPS/P2型石蜡包埋中心,德国SLEES 2052/22型全自动脱水机,德国SLEEMNT型冷冻切片机,电热恒温箱,以及万能显微镜。

  1.1.2 实验动物 体质量为(130±10)g的Wistar大鼠32只(购自青岛市药检所动物房),雌雄各半。将实验动物随机分为空白对照组(Ⅰ组)、橄榄油对照组(Ⅱ组)、溴氰菊酯1.56 mg/kg组(Ⅲ组)、溴氰菊酯6.25 mg/kg组(Ⅳ组),每组8只。

  1.2 方法

  1.2.1 染毒方式 大鼠于实验环境中,即室温为(20±5)℃、24 h自然光照条件下饲养,自由饮水进食,适应1周。不同剂量的溴氰菊酯分别以5 mL/kg的橄榄油溶解后,采用灌胃染毒,染毒剂量基于WHO公布的大鼠灌胃半数致死量(139 mg/kg)的1/20和1/60而确定。每日9:00固定灌胃,染毒5 d休息2 d,连续染毒6个月。

  1.2.2 取材及标本制作 大鼠在禁食、但自由饮水24 h后经水合氯醛腹腔麻醉处死。立即取出肝脏,用生理盐水冲洗干净肝脏表面的血污后滤纸吸干,用40 g/L多聚甲醛固定24~48 h, 6 μm厚切片,分别作苏木精?伊红染色和PAS染色。

  1.2.3 脏器系数的计算 实验结束时测定各组大鼠体质量,经腹腔麻醉处死,分离所需脏器,除去器官周围的脂肪及结缔组织,用生理盐水冲洗净脏器表面血污后滤纸吸干,称质量并计算脏器系数。具体计算公式为:脏器系数=该脏器的质量/动物体质量×100[8]。

  1.2.4 苏木精?伊红染色 肝组织切片入苏木精液10 min,水洗,盐酸乙醇分色及氨水反蓝,水冲洗,入梯度乙醇及醇伊红复染,二甲苯透明,中性树胶封片。镜下观察一般肝组织结构的形态学变化。

  1.2.5 PAS染色 切片入10 g/L过碘酸水溶液5 min,水冲洗;入Schiff试剂15 min,亚硫酸盐溶液洗3次,水洗,吸干;乙醇梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。镜下观察糖原颗粒,阳性反应呈紫红色块粒状。

  1.2.6 肝糖原含量计量 PAS染色切片采用组织学半定量法[9],进行肝细胞糖原含量的评估,即细胞质内有超强反应物或大量颗粒的细胞定为4级(?),为4分;有强度反应物或中强量颗粒的细胞定为3级(?),为3分;有中度反应物或中等量颗粒的细胞定为2级(?),为2分;有弱度反应物或少量颗粒的细胞定为1级(+),为1分;无反应的细胞定为0级。于40倍物镜下每张切片中随机选择3个糖原区域作为观察视野,进行肝糖原含量的评估。

  1.2.7 统计学处理方法 所有数据用SPSS 16.0及PPMS 1.5[10]统计软件进行数据处理,数据以±s表示,组间比较采用方差分析。

  2 结 果

  2.1 行为变化

  Ⅲ、Ⅳ组大鼠于染毒第2周普遍出现食欲不振,精神萎靡,行动迟缓,大量流涎,皮肤大量出汗,后肢痉挛,抽搐,毛发无光泽并竖起,站立不稳,部分动物还有轻度瘫痪,尤以Ⅳ组中毒症状最为严重。Ⅰ、Ⅱ组未见明显异常。

  2.2 脏器系数的变化

  染毒结束时,Ⅰ~Ⅳ组的肝脏器系数分别为3.19±0.25、3.21±0.42、2.88±0.30和2.51±0.41。染毒组大鼠肝的脏器系数随染毒剂量的增加有不同程度的降低,Ⅲ组和Ⅳ组肝脏器系数分别与其他各组比较,差异有统计学意义(F=10.737,q=3.945-9.968,P<0.05),Ⅰ组和Ⅱ组比较差异无统计学意义(q=0.373,P<0.05)。

  2.3 病理学变化

  2.3.1 光镜下苏木精?伊红染色观察 Ⅰ组大鼠肝脏的肝小叶分界不明显,小叶间结缔组织很少,肝细胞索排列整齐,肝细胞形态正常,血窦及中央静脉内未见淤血。Ⅱ组肝细胞形态结构正常,胞浆内偶见有微小脂肪空泡形成,肝细胞索排列整齐,血窦及中央静脉内未见淤血。Ⅲ组可见部分肝细胞水肿及胞浆疏松,染色浅淡,大小不一的脂肪空泡呈弥漫性分布,肝细胞索排列较齐,部分中央静脉和肝血窦扩张淤血,内可见红细胞,偶见淋巴细胞。Ⅳ组肝细胞水肿明显,胞浆疏松,染色浅淡,大而圆的脂肪空泡弥漫分布于整个视野,肝细胞索排列较齐,中央静脉和肝血窦扩张淤血明显,里面充满红细胞,可见淋巴细胞。

  2.3.2 光镜下PAS染色观察 Ⅰ、Ⅱ组大鼠肝细胞中,糖原含量丰富,被染成紫红色,分布于胞质中。糖原颗粒的大小形状不一,有的细小散在分布,有的凝集成较大团块或成群堆积,肝小叶中各肝细胞的糖原含量不等。Ⅲ组可见有少量紫红色糖原颗粒分布于胞质中,Ⅳ组胞质中偶见有紫红色的糖原颗粒。Ⅰ~Ⅳ组的肝细胞糖原含量分别为2.70±0.95、2.41±0.71、2.33±0.48、1.67±0.64。染毒组大鼠肝细胞的糖原颗粒含量有不同程度降低,Ⅳ组与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组相比,Ⅲ组和Ⅰ组相比差异有统计学意义(F=9.015,q=3.675-10.058,P<0.05);但Ⅱ组与Ⅲ组之间比较,差异无统计学意义(q=0.672,P>0.05)。

  3 讨 论

  目前的研究显示,溴氰菊酯是一种神经毒剂,主要作用于中枢神经系统,其急性中毒研究较多,症状可表现为流涎、兴奋性过高、肌肉震颤、舞蹈手足徐动症,甚至是癫痫样发作[11?13]。本文结果显示,给予溴氰菊酯慢性染毒后,动物出现精神萎靡、行动迟缓,流涎,皮肤大量出汗,后肢痉挛,毛发无光泽并竖起,站立不稳等症状,提示长时间低剂量溴氰菊酯染毒可导致大鼠出现神经系统慢性中毒症状。

  动物脏器系数是毒理学亚慢性毒性实验中检测受试物毒性作用的重要指标,其变化可反映化学毒物对该脏器的毒性作用的综合情况[8]。本研究结果表明,Ⅲ、Ⅳ组大鼠的肝脏器系数随染毒剂量的增加而减小,与其他各组相比差异均有显著性,提示在Ⅲ、Ⅳ组剂量的溴氰菊酯慢性染毒,对大鼠的肝具有较明显的毒性损伤作用。

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