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人TNF?α重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞表达

2017-11-11 16:00:05    作者:admin    www.5alw.com

                     作者:马贵亮 毛伟征 杨? 安岗 岱震波

 

【摘要】  目的 构建带有人TNF?α基因的慢病毒载体,并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达。方法 通过逆转录聚合酶链反应(RT?PCR)从PCD DNA?TNF?α质粒中获得人TNF?α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC?FU?TNF?α,在脂质体Lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelper 1.0和包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC?FU?TNF?α)、空载体对照组(pGC?FU?EGFP)及空白组(脐血间质干细胞),分别用重组慢病毒、空载慢病毒、PBS感染后,采用RT?PCR以及ELISA方法检测TNF?α表达。结果 所获TNF?α基因测序证明与GenBank中序列一致;重组慢病毒载体质粒pGC?FU?TNF?α经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107 TU/L,感染脐血间质干细胞后RT?PCR、ELISA检测3组细胞均有TNF?α表达,其中实验组大量表达TNF?α,与其余两组比较差异有显著性(F=11.677、21.321,P<0.01)。结论 成功构建带有TNF?α基因的慢病毒载体并实现在脐血间质干细胞中的表达,为脐血间质干细胞转基因治疗胃癌的应用奠定基础。

【关键词】  慢病毒感染;遗传载体;肿瘤坏死因子α;基因;脐血;间质干细胞

 [ABSTRACT] Objective To construct a lentiviral vector carrying human TNF?α gene,and observe its expression in human umbilical cord blood mesenchymal stem cells (UCBMSCS). Methods Human TNF?α gene was obtained with reverse transcription polymerase chain reaction (RT?PCR) from PCD DNA?TNF?α plasmid. The TNF?α gene was recombined to construct the transfer plasmid pGC?FU?TNF?α by infusion technique. The 293T cells were cotransfected with the transfer plasmid pGC?FU?TNF?α, the construction plasmid Helper 1.0 and the envelope plasmid Helper 2.0 with the help of lipofectamine 2000 to produce lentiviral particles. Human UCBMSCS were divided into experimental group (pGC?FU?TNF?α), mock group (pGC?FU?EGFP) and blank group (UCBMSCS), which were infected by recombinant lentiviral particles, empty lentiviral particles and PBS, respectively. The expression of TNF?α was observed by RT?PCR and ELISA. Results The results of gene sequencing showed that the cloned TNF?α gene was consistent with the sequence reported in GenBank. The pGC?FU?TNF?α plasmid was identified to have correct sequence. After the three plasmids of lentiviral vectors were cotransfected to the 293T cells, the supernatant was collected and concentrated. The titer of the lentiviral vector particles was 2×107 TU/L. After the constructed lentiviral vectors infected the UCBMSCS, TNF?α expression detected with RT?PCR and ELISA was found in all three groups, but the expression of TNF?α in the pGC?FU?TNF?α group was significantly higher than that in the pGC?FU?EGFP group and the UCBMSCS group at both mRNA and protein levels (F=11.677,21.321;P<0.01). Conclusion Lentiviral vector carrying TNF?α gene has been successfully constructed. The infected human UCBMSCS can express TNF?α protein. The results of present study provide basis for application of UCBMSCS gene transfer therapy in the treatment of gastric carcinoma.

  [KEY WORDS] lentivirus infection; genetic vector; tumor necrosis factor?alpha; gene; umbilical cord blood; mesenchymal stem cell

  肿瘤坏死因子?α(TNF?α) 是一种重要的免疫调节因子, 具有杀伤和抑制肿瘤的作用[1]。 体外研究表明,TNF?α是目前发现最有效的肿瘤杀伤因子之一,但全身给药难以达到体外实验中有效的抗肿瘤效果。脐血间质干细胞具有多向分化潜能及定向肿瘤部位迁移并构成肿瘤间质的特性[2]。本实验通过构建人TNF?α重组慢病毒感染脐血间质干细胞使其成为TNF?α基因的载体,观察TNF?α在脐血间质干细胞中的表达。

  1 材料和方法

  1.1 实验材料

  细胞和质粒:慢病毒表达载体穿梭质粒pGC?FU Vector (含有EGFP基因)和慢病毒结构质粒pHelper 1.0 及慢病毒包膜蛋白质粒pHelper 2.0,购自 Genechem公司; 感受态大肠埃希菌DH5?、TNF?α基因表达质粒PCD DNA?TNF?α,来自我院中心实验室;人胚肾上皮细胞系293T细胞、人脐血间质干细胞,来自我院中美干细胞中心。试剂和引物:限制性内切酶AgeⅠ,NEB公司;In?Fusion kit,BD公司;Taq polymerase,Takara公司;Primer,上海吉凯基因技术有限公司;BSA,上海捷倍思基因技术有限公司;Lipofectamine 2000, Invitrogen 公司;Plasmid 抽提 Kit,QIAGEN公司;PCR提取Kit,宝生物(大连)有限公司。

  1.2 方法

  1.2.1 引物设计与合成 根据pGC?FU Vector的要求在引物中加入Age Ⅰ酶切位点ACCGGT,用于PCR扩增TNF?α基因,F: 5′?CAGGATCCCCG?GGTACCGGTCGCCACCATGAGCACTGAAAGC?ATGATC?3′;R:5′?TCACCATGGTGGCGACCG?GTACCAGGGCAATGATCCCAAAG?3′, 产物大小为527 bp。PCR 鉴定目的基因重组连接的阳性克隆菌落,其中F:5′?TGACAAGCCTGTAGCCCA?T?3′,R:5′?CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG?3′,产物大小为527 bp。TNF?α基因引物,F:5′?TGA?CAAGCCTGTAGCCCAT?3′,R:5′?CGTCGCCGT?CCAGCTCGACCAG?3′。内参GAPDH 基因引物,F:5′?AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA?3′,R:5′?GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA?3′。上述引物设计与合成均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

  1.2.2 重组慢病毒载体质粒的构建 采用PCR技术从PCD DNA?TNF?α中扩增目的基因(TNF?α),PCR反应条件:94 ℃变性30 s后,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共20个循环,最后再于72 ℃延伸10 min。用AgeⅠ酶分别酶切载体pGC?FU Vector和上述PCR产物,琼脂糖电泳分离纯化。将酶切回收载体DNA、酶切回收的PCR产物、In?Fusion交换酶及buffer与ddH2O加入反应体系,于23 ℃反应15 min,再于42 ℃反应15 min制备克隆交换液,转化DH5?。PCR 鉴定细菌阳性克隆, 命名为pGC?FU?TNF?α,送往上海生工基因公司测序。

  1.2.3 病毒的包装、收集 用LB培养液扩增转化菌DH5?,Plasmid 抽提 Kit提取骨架质粒pGC?FU?TNF?α、包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0。转染前24 h,用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞,以含体积分数0.10 血清的培养基调整细胞密度为6.0×108/L,重新接种于15 cm 细胞培养皿,37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱内培养24 h,待细胞达70%~80%融合时即可用于转染。转染前24 h 将细胞培养基更换为无血清培养基。应用慢病毒穿梭质粒、结构质粒和包膜蛋白质粒,按Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明进行共转染包装细胞293T细胞,细胞转染后8 h更换为完全培养基,培养48~72 h后观察,出现强绿色荧光并有细胞融合现象时,收集含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高浓度的慢病毒浓缩液, 分装后保存在病毒管中,-80 ℃保存。

  1.2.4 病毒滴度测定 ①逐孔稀释滴度测定法检测病毒滴度:分别取10 倍比稀释的病毒液100 μL,加入96孔板,8 h后,换为新鲜培养基。4 d后,观察细胞荧光及生长状况,并收取细胞进行后续滴度测定。 ②实时荧光定量PCR检测病毒滴度:抽提细胞总RNA,逆转录获cDNA。以GFP基因引物(F:5′?TGCTTCAGCCGCTACCC?3′,R:5′?AGTTCA?CCTTGATGCCGTTC?3′)、Actin基因引物(F:5′?GTGGACATCCGCAAAGAC?3′,R:5′?AAAGGG?TGTAACGCAACTA?3′)两步法行实时荧光定量,95 ℃预变性15 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火延伸30 s,共40 个循环,制作熔解曲线。

  1.2.5 重组慢病毒pGC?FU?TNF?α在脐血间质干细胞中的表达检测 ①脐血间质干细胞的培养与感染:脐血间质干细胞加入含体积分数0.10胎牛血清的低糖DMEM 细胞培养基(Gibco)中,置37 ℃、体积分数0.05的CO2饱和湿度的孵箱中培养。 当细胞长到80%融合时,用2.5 g/L胰酶消化,将脐血间质干细胞分3组接种于6孔板, 实验组为带有TNF?α基因慢病毒感染的脐血间质干细胞 (pGC?FU?TNF?α组), 空载体对照组为未携带任何目的基因慢病毒感染的脐血间质干细胞(pGC?FU?EG FP),空白组为未经感染的脐血间质干细胞, 每孔细胞数为5×104个。待细胞融合度达到30%,换液加入2 mL低糖DMEM培养液, 10 g/L的polybrene 1 μL, 实验组加入感染复数(MOI值)为10的重组慢病毒 10 μL, 空载体对照组加入空载慢病毒1 μL,空白组加入PBS 1 μL,72 h后观察荧光。② RT?PCR 检测:分别抽提3组细胞总RNA,加入GAPDH基因引物作为内参, 同时加入TNF?α基因引物行RT?PCR 反应以及灰度分析,检测各组脐血间质干细胞中TNF?α基因mRNA表达情况。每组随机读取5 次灰度分析数据,取二者比值平均值。③ ELISA检测:收集3组上清行TNF?α蛋白检测,按ELISA试剂盒说明书操作,检测不同浓度TNF?α标准品及各组细胞上清液在波长450 nm处吸光度(A)值,根据A值计算各组上清液TNF?α浓度。

  1.3 统计学处理

  应用PPMS 1.5统计学软件[3]进行数据处理,结果以±s表示,数据间比较采用方差分析,两两比较采用q检验。

  2 结 果

  2.1 慢病毒载体表达质粒pGC?FU?TNF?α 构建

  电泳结果示,748 bp 处有特异条带,与预计产物大小一致,表明已成功提取TNF?α 基因(图1); 慢病毒载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱见图2; TNF?α重组质粒阳性克隆PCR 鉴定,琼脂糖电泳可见527 bp 目的片段,与预计PCR产物大小一致,初步确认成功构建重组质粒(图3)。测序结果显示,pGC?FU?TNF?α中TNF?α序列与GenBank中正常NM_000594序列完全一致。

  2.2 包装细胞293T 细胞转导pGC?FU?TNF?α 质粒后绿色荧光蛋白(EGFP)的表达

  将pGC?FU?TNF?α质粒转导入293T细胞后,其TNF?α蛋白的表达与EGFP的表达是一致的。将pGC?FU?TNF?α质粒和包装质粒pHelper 1.0、 pHelper 2.0 共同转染293T细胞12 h后,在荧光显微镜下可以看到EGFP的表达呈阳性。

  2.3 携带重组慢病毒的包装和病毒滴度

  本文三质粒共转染293T细胞, 成功包装表达TNF?α基因和EGFP基因的慢病毒pGC?FU?TNF?α,实时荧光定量PCR 结果显示,3~10 μL 样品和其后更低稀释度样品之间基因表达有一定差异,其后样品基因表达和空白对照组相比差异无显著性,因此评估3~10 μL 样品中仍有病毒颗粒,该批病毒的滴度为2 ×107TU /L,Actin 及感染样品熔解曲线均呈单峰,可排除引物二聚体影响。

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