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曲美他嗪对糖尿病心肌病变大鼠MMP-9、TIMP-1与TGF-β1 蛋白表达的影响

2017-11-13 20:00:07    作者:admin    www.5alw.com
【摘  要】 目的  探讨曲美他嗪对糖尿病(DM)大鼠心肌纤维化的影响。方法  SD大鼠50只,随机分为对照组(NC),糖尿病心肌病组(DCM),曲美他嗪治疗组(QMTQ)。免疫组化法、Western印迹技术检测转化生长因子TGF-β1、基质金属蛋白酶(MMP)-9及组织型基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-l蛋白表达及含量。结果  与NC组相比,DCM组中MMP-9、TIMP-1及TGF-β1蛋白表达及含量均明显升高.MMP-9/TIMP-l比值降低。QMTQ组上述异常均明显减轻。结论  MMP-9、TIMP-l 及TGF-β1三者平衡失调可能是使DM心肌纤维化发生的机制之一,曲美他嗪可能是通过下调TGF-β1表达,升高MMP-9/TIMP-1比值,保持心肌间质胶原合成和降解的动态平衡,而抑制糖尿病心肌纤维化的发生。
【关键词】 曲美他嗪;糖尿病心肌纤维化;转化生长因子;基质金属蛋白酶
        DCM作为DM的一种独特的心脏并发症已得到公认,其主要病理改变为心肌细胞肥大、凋亡和心脏间质纤维化(MF),其纤维化的发生机制不完全清楚。基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶抑制物(MMPS/TIMPS)共同构成体内调节细胞外基质动态平衡的最重要的系统,参与了多种原因所致的心脏间质纤维化过程[1]。曲美他嗪作为改善心肌细胞能量代谢药物已在临床中已广泛应用,但其对糖尿病心肌纤维化的研究报道较少。本试验予曲美他嗪对DM大鼠MF的影响,探讨MMP-9/TIMP-1及TGF-β1 在DCM发生过程中的作用,为临床DCM的治疗提供参考。
        1  对象和方法
        1.1  对象
         选2 月龄健康雄性SD大鼠(180~200 g)50 只(由辽宁医学院实验动物中心提供);链脲佐菌素(STZ)(购自美国Sigma公司);曲美他嗪(武汉福达医药化工有限公司);MedLab生物信号采集处理系统(南京美易公司);TUNEL试剂盒(购自北京博奥森生物技术有限公司);P53、Bax、Bcl-2兔抗小鼠单克隆抗体(购自北京中杉金桥生物有限公司)。
        1.2  模型与分组
         健康雄性SD大鼠50 只,随机分出10 只作为正常对照组(NC),其余以45 mg?Kg-1一次性尾静脉注射1%STZ溶液,正常对照组注入等量容积上述缓冲液。注射后72 h采尾静脉血测血糖,血糖浓度大于16.7 mmol?L-1者为糖尿病大鼠模型。糖尿病模型形成后,普通饲料喂食6 周,随机抽取大鼠10 只,取心肌组织观察微细结构,糖尿病心肌病变模型形成标准为:心肌肌原纤维排列紊乱,局部断裂明显,肌丝成分减少,间质胶原纤维增生;心肌内微血管内皮细胞明显肿胀,核染色质边集,基底膜出现不规则明显增厚,微血管瘤形成;线粒体肿胀变形、嵴稀疏,排列紊乱,结构不清。按随机数字表方法将糖尿病大鼠随机分为两组:糖尿病心肌病组(DCM),曲美他嗪(QMTQ)治疗组。最终用于实验的动物为对照组10 只,模型组10只,治疗组10 只。糖尿病大鼠心肌病变模型制备成功后开始给药,持续6 周。治疗组给予曲美他嗪10 mg?kg-1,每天灌胃一次,给药容量为10 ml?Kg-1,NC组和DCM组给予等容量纯净水。
        1.3  指标测定
        1.3.1  免疫组化检测测定MMP-9、TIMP-1、TGF-β1蛋白表达水平
         石蜡切片放入恒温水浴槽烤片2 h,常规酒精从低到高浓度脱蜡至水,置入3%H2O2中灭活内源性过氧化物酶。将切片浸入含0.01 M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)的高压锅内,盖上压力阀至喷气后持续2~3 min抗原修复,自然冷却后PBS(pH7.2~7.6)洗涤。滴加5%BSA封闭液,室温20 min,滴加1:100稀释MMP-9、TIMP-1、 TGF-β1兔抗鼠单抗,4 ℃过夜。PBS洗涤后滴加生物素化山羊抗兔IgG,室温20 min,PBS洗2 min×3 次。滴加SP复合物,室温20 min,PBS洗2 min×4 次。DAB显色,蒸馏水洗涤,苏木素轻度复染,逐级酒精脱水,透明,封片。光镜下观察摄片,每张切片于左上、左下、右上、右下及中部随机取5 个高倍视野(×400)测量灰度值,将每张切片平均灰度值作为该切片的灰度值。
        1.3.2  Western-blot法检测MMP-9、TIMP-1、TGF-β1蛋白含量
         心肌组织匀浆取上清液,提取蛋白样品,按秩序加入泳道进行SDS.PAGE,转膜,抗体孵育,碱性磷酸酶显色。检测免疫复合物,利用凝胶自动分析软件,以β-actin作为内参,对蛋白条带进行分析得出数据文件。
        1.4  统计学分析
         统计学分析应用SPSS16.0统计软件进行处理。实验数据采用均数±标准差(x±s)表示,组间比较用单因素方差分析,两两比较用q检验。P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异有显著统计学意义。
        2  结果
        2.1  大鼠的一般情况
         实验期间NC组大鼠精神状况良好,反应灵敏;DCM组大鼠明显消瘦,精神萎靡,因感染或糖尿病加重死亡5 只;治疗组因麻醉过重死亡3 只,治疗期间死亡2 只,与DCM组相比,精神状态尚可,无失明发生。DCM组大鼠体重明显降低,QMTQ组与DCM组相比,体重显著增加。
        2.2  大鼠心肌组织MMP-9、TIMP-1、TGF-β1蛋白表达
        2.2.1  免疫组化法(灰度值测定)
         与NC组相比,DCM组和QMTQ组MMP-9、TIMP-1、TGF-β1三者蛋白表达灰度值均显著降低(即含量显著增高,P?0.01),MMP-9/TIMP-1灰度值比值显著升高(即含量比值显著降低,P?0.01);与DCM组相比,QMTQ组MMP-9、TGF-β1蛋白阳性表达灰度值增高(即含量降低,P?0.05),TIMP-1蛋白阳性表达灰度值显著增高(即含量显著降低,P?0.01),MMP-9/TIMP-1灰度值比值显著降低(即含量比值显著升高,P?0.01)(表1,表2)。
        表1  三组大鼠心肌TGF-β1、MMP-9、TIMP-1蛋白灰度值比较(±s)   
组别nTGF-β1MMP-9TIMP-1    
NC组
DCM组
QMTQ组10
10
10115.74±11.63
95.48±9.21*
106.26±5.18*▲121.29±6.76
104.83±8.25*
110.92±9.94*▲121.42±9.20   
85.97±10.03*    
100.93±10.83*? 
注:与NC组比较,*P<0.01;与DCM组比较,▲P<0.05,?P<0.01
表2  三组大鼠心肌MMP-9/TIMP-1灰度值比值比较(±s)   
   组别nMMP-9/TIMP-1   
NC组
DCM组
QMTQ组10
10
101.02±0.03     
1.31±0.06*     
1.18±0.02*?    
        注:与NC组比较,*P<0.01;与糖尿病组比较,?P<0.01
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