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HIF-1 与肿瘤血管生成的相关性研究进展

2017-12-07 00:00:03    作者:admin    www.5alw.com

                        作者:王勇  郭淑琴 张云良  程晓东

  【摘 要】 缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)是由α亚基和β亚基组成的异二聚体转录因子,在肿瘤发生发展过程中起着重要的作用。本文结合HIF-1 的结构和功能特点,详细综述了HIF-1 对肿瘤血管生成的主要调节机制,对以HIF-1 为作用靶点的肿瘤临床治疗前景作了简要展望。
  【关键词】 HIF-1;肿瘤;调节机制;治疗靶点
  现代研究认为,恶性肿瘤的显著特征是肿瘤细胞的大量增殖和转移。其中,细胞大量增殖导致的组织缺氧是肿瘤的基本微环境,缺氧可以刺激肿瘤细胞一系列基因产物的表达诱导微血管生成,新生微血管不仅为肿瘤细胞带来营养成分,带走代谢产物,同时肿瘤细胞也可以通过新生的毛细血管发生转移。近年的研究表明[1] , 缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)可在基因水平上直接调控血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,并促进肿瘤生长。本文就HIF-1 与肿瘤的相关性研究作一简要综述。
  1 HIF-1 的结构和功能
  HIF-1 最先由Semenza 和Wang 于1992 年发现,将其作为被缺氧诱导的连接在EPO 基因诱导元件上的一个核因子 [2]。HIF-1 是由α 亚基和β 亚基组成的异二聚体转录因子,由A、B、C、D 四条链组成。其中A、B 链是DNA 分子,均由14 个碱基组成。C 链为β 亚基,与已知的芳香烃受体核转位蛋白( aryldrocarbon receptor nuclear translocator ,ARNT)相同,其开放阅读框有2367bp 和2322bp2种,分别编码789 和774 个氨基酸,分子量为80kD。D 链是α 亚单位,人类HIF-1α 基因定位于14q21-24,含有826 个氨基酸,分子量为120 kD,是HIF-1 的调节和活性亚基[3]。HIF-1α 和HIF-1β 的共同特点:N 端具有基本螺旋- 环- 螺旋( basic helix-loop-helix,bHLH)结构的碱性蛋白,其后紧随PAS(Per-ARNT-Sim)区域,bHLH 和PAS 区域主要介导异源二聚体的形成,以及负责与DNA 的缺氧反应元件(hypoxia response elements,HRE)结合[4],另外在C 端具有一个或多个反式激活域(trans-activation domains,TAD),负责与转录起始复合物结合参与转录活化[5]。HIF-1α 的C-TAD 与N-TAD 之间576~785 位氨基酸序列为抑制结构域,能降低TAD 的活性,在常氧细胞中该抑制明显。另外,HIF-1α 还包含两个核定位信号(nuclear localization signal,NLS):N-端核定位信号和C-端核定位信号,C-NLS 在HIF-1α 核定位方面发挥更为重要的作用。HIF-1α常氧状态下极不稳定,半衰期小于5~10 分钟,Huang LE 等[6]1998 年发现,在HIF-1α 401~603 区域, 有一个氧依赖降解区( oxygen-dependent degradation domain,ODD),其中一部分与N-TAD重合,负责HIF-1α 的降解。当环境氧的浓度超过5%时,通过激活泛素?蛋白酶体路径,作用于HIF-1α的ODD 区,使其迅速降解。如果截去ODD 区,可以使HIF-1α 在有氧状态下保持稳定,并且仍可与ARNT 形成二聚体及与DNA 结合,此时即使环境不缺氧,它也具有完整的转录活性。HIF-1α 羧基端含有PEST?样基序,因富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸,其主要作用是加速常氧下ODD 介导的HIF-1α 蛋白经泛素?蛋白酶复合体途径降解。HIF-1 的两个亚单位中,HIF-lβ 与细胞的多种功能有关而不仅限于O2 代谢,HIF-1α 则仅与O2 代谢有关。HIF-1β 在细胞中组成性表达,而α 亚基是HIF-1 的调节和活性亚基。HIF-1α 蛋白常氧状态下极不稳定,但能在缺氧条件下保持稳定,并且是组织缺氧的内在标志[7]。
  2 HIF-1 调节肿瘤血管生成的相关机制
  大量的研究表明,在多数恶性肿瘤组织内,HIF-1 都有一定程度的表达,然而,HIF-1 在不同肿瘤中高表达的机制不尽相同,而这些不同的机制下诱导的HIF-1 的表达参与了肿瘤的不同的恶性生物学行为。Birnal 等[8]进一步研究发现HIF-1α 的表达亦与肿瘤细胞的增殖、浸润及转移能力相关,其表达越高,预后越差。大量新生血管形成及糖酵解增强是实质性恶性肿瘤的两个主要特征,正是这两个特征使得肿瘤细胞能够适应缺氧环境。HIF-1 下游基因既参与血管生成,又参与无氧糖酵解,因此,HIF-1 在瘤细胞适应缺氧环境过程中起中心介导作用,是诱导肿瘤血管生成的核心分子[9]。HIF-1 调节血管生成的主要机制可分为VEGF 依赖途径和VEGF 非依赖途径两类。
  2.1 VEGF 依赖途径
  HIF-1 通过诱导VEGF 表达,特异地结合位于血管内皮细胞上的特异受体Flt-1 和KDR,促进内皮细胞生长,增加血管通透性,进而促进血管生成。VEGF 是血管生长的主要因子,各种类型细胞中VEGF 的表达随氧气浓度的降低而升高,如低氧培养的细胞VEGF mRNA 水平和蛋白明显升高,恢复正常氧张力时则回降;坏死区周围肿瘤细胞的VEGF mRNA 呈高度表达,说明局部低氧是肿瘤微环境内VEGF 基因表达的主要诱因。Maxwell 等[10]在小鼠皮下种植HIF-1β 突变的肝癌细胞,发现移植瘤生长缓慢,免疫组化示微血管密度显著减少,采用原位杂交技术发现VEGF mRNA 表达近缺失。Ravi 等[11]发现经转染HIF-1α 表达载体的HCT116结肠癌细胞,VEGF 蛋白表达显著增加,异种移植瘤生长速度加快,血管化作用增强。研究发现,HIF-1 通过增强VEGF 的转录活性与增加VEGF
mRNA 稳定性两个方面调节VEGF 的稳定表达[12]。进一步研究表明,HIF-1 对VEGF 的调控首先在于其与HRE 的结合,激活C-TAD,使之与p300/CBP环腺苷酸反应元件结合蛋白CH1 的结合力增强,通过此核磷酸蛋白将转录信号传递给VEGF 基因,促进VEGF 的转录及表达[13]。体外细胞培养表明,通过转基因手段强制表达HIF-1 后,在低氧和正常氧分压条件下VEGF的表达均明显增加。有研究表明,去除VEGF 的增强子或诱导HIF-1 结合位点序列内出现点突变则HIF-1 对VEGF 调控作用就不复存在,此时VEGF mRNA 水平显著降低,即使在低氧
条件下,VEGF mRNA 也未被诱导表达[14, 15]。另外,缺氧状态下VEGF mRNA 5’非转录区存在内部核糖体插入位点(internal ribosome entry site,IRES),能保护VEGF mRNA 进行蛋白质翻译[16]。这些表明HIF-1 在VEGF mRNA 的稳定表达方面起到了一定作用。另外,HIF-1 可以上调VEGF 受体Flt-1 的转录,Flt-1 的大量表达,加强了VEGF 的生物学效应[17]。最新研究还提示,VEGF mRNA 的3’非转录区富含腺核苷酸-鸟核苷酸(AU),缺氧时高表达的RNA 结合蛋白HuR 与富含AU 的元件具有特别亲和力,HuR 则可使VEGF mRNA 在有氧状态下也不被降解,HuR 表达与HIF-1 密切相关[18]。
  2.2 VEGF 非依赖途径
  VEGF 非依赖途径主要是HIF-1 通过促进其他因子表达或癌基因发生作用[19]。体外细胞实验证实,HIF-1 可诱导人内皮细胞环氧合酶-2(COX-2)的表达,而COX-2 及其合成产物前列腺素等可通过除VEGF 以外的碱性成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、表皮生长因子及胰岛素样生长因子等多种途径调节血管生成。国内学者分别将合成的具有HIF-1 特异结合位点的DNA 片段红细胞生成素3’-增强子(EPO 3’-enhancer)及HIF-1 结合位点突变的DNA 片段,经脂质体包裹转入鼠主动脉内皮细胞与肺微血管内皮细胞,应用RT-PCR 对COX-2 的表达进行半定量观察。发现在缺氧时,主动脉和微血管内皮细胞COX-2 的表达都有增加,但经转入EPO 3’DNA 片段的内皮细胞,缺氧对COX-2 的诱导作用被显著减弱,转入将HIF-1 结合位点突变的DNA 片段则无此抑制作用。据此推测缺氧诱导COX-2 表达时,HIF-1 在其信息传递中可能起着关键作用。氯化钻(CoCl2)是特异性的HIF-1诱导剂,在其作用下体外培养的人脐静脉内皮细胞COX-2 mRNA 水平显著提高,提示CoCl2 可使COX-2 基因转录明显增强,而向细胞导人EPO 3’-增强子野生片段可阻断CoCl2 诱导的COX-2 转录,若导入点突变片段则无阻断作用。进而推断COX-2基因序列中可能存在类似的HIF-1 结合序列,HIF-1诱导COX-2基因表达增强可能主要通过HIF-1 与该序列的结合实现,由于EPO 3’-增强子片段对HIF-1竞争性结合抑制,导致被转入细胞对缺氧反应的减弱。Naomoto 等[20]的研究也证实了HIF-lα 可能通过COX-2 途径在多种肿瘤的血管生成中起重要作用。但是缺氧条件下,HIF-1 调节肿瘤血管生成还是以VEGF 依赖途径为主。
  3 HIF-1 与肿瘤治疗
  肿瘤组织内的缺氧环境可以诱导HIF-1α 的表达,继而诱导下游多种靶基因的转录和表达增强,尤其HIF-1α 诱导VEGF 表达途径,在促使肿瘤的微血管的生成,肿瘤细胞的生长代谢以及恶性转化过程中起到了重要的枢纽作用。目前,HIF-1α 在肿瘤治疗方面的研究大致可分为药物治疗和基因治疗两类。接下来我们结合这两种研究思路,总结并展望一下以HIF-1 为靶点的肿瘤治疗前景。
  3.1 药物治疗 
目前,正在研究的抑制HIF-1 活性药物大体可分为两类:①阻断相关信号转导通路;②小分子HIF-1 活性抑制剂。可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂YC-1 能够有效抑制HIF-1α 表达,且能够抑制VEGF的表达,减弱血管化作用[21]。热休克蛋白90 抑制剂格尔德霉素,通过抑制热休克蛋白90 与HIF-1α结合而使HIF-1α 稳定性消失[22]。苯甲酸类似物是一类新的HIF-1 抑制剂,能够有效地抑制缺氧时人类肝癌Hep3B 细胞中HIF-1α 蛋白集聚和其靶基因的表达[23]。雷帕霉素可通过下调HIF-1α 和VEGFmRNA 的水平而抑制肝癌的生长和转移[24]。非甾体消炎药和缺氧性细胞毒素TX-402,亦可通过阻断或抑制HIF-1 的表达来抑制血管生成。在脑胶质细胞瘤中, 一种新发现的小分子HIF-1α 抑制剂103D5R[25]以及ras 癌基因抑制剂[26],可通过减少HIF-1α 蛋白合成而抑制其下游靶基因的表达。最新研究表明,组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丁酸钠在低氧环境下,能够通过抑制HIF-1 介导的血管生成抑制HT1080 人纤维肉瘤细胞的生长[27]。
  3.2 基因治疗
  肿瘤的基因治疗的关键在于肿瘤特异性的载体的开发,通过其结合肿瘤特异性表位以实现基因治疗。Ruan 把自杀基因Bax 反义RNA 导入HRE的下游,在缺氧状态下转染了自杀基因质粒的细胞优先凋亡[28]。另外可以通过利用反义RNA 来抑制HIF-1 的活性,利用RNA 干扰配合放疗[29]。反义HIF-1α 可能通过阻断HIF-1α 和survivin 的表达而增强胰腺癌对化疗的敏感性[30]。酪蛋白激酶2(CK2)siRNA 可通过升高p53 蛋白水平降低缺氧时HIF-1 活性[31]。利用表达pshHIF-1α(plasmid DNA expressing short hairpin RNA targeting HIF-1α)的质粒DNA 转染Colon26 和B16-BL6 细胞,能在体外有效抑制HIF-1α 的表达, 且经门静脉注入pshHIF-1α 至荷瘤鼠肝脏中,正常肝细胞和肿瘤细胞HIF-1α 蛋白表达均降低,通过沉默正常和肿瘤细胞中HIF-1α 表达,抑制肝转移瘤生长可成为新的治疗方法[32]。 
参考文献
[1] Detwiller KY, Fernando NT, Segal NH, et al. Analysis of hypoxia-related gene expression in sarcomas and effect of hypoxia on RNA interference of vascular endothelial cell growth factor A[J]. Cancer Res, 2005,65(13): 5881-5889
[2] Semenza GL, Wang GL. A nuclear factor induced by hypoxia via
de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene
enhancer at a site required for transcriptional activation[J]. Mol Cell Biol, 1992,12(12): 5447-5454.
[3] Fujita M,Yasuda M,Kitatani K,et al.An up-to-date anticancer
treatment strategy focusing on HIF-1alpha su- ppr ession: its application for refractory ovarian cancer[J].Acta Histochem Cytochem, 2007,40(5): 139-142.

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