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针刺对脑缺血大鼠神经元凋亡的影响

2017-12-16 16:00:02    作者:admin    www.5alw.com

【摘要】  目的 观察针刺对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后海马神经元内细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶4(CDK4)和神经元凋亡的影响。方法 大脑中动脉线栓法建立脑缺血再灌注损伤模型,再灌后针刺大鼠,应用免疫组化、免疫印迹法和流式细胞计数法分别检测CDK4和细胞凋亡。结果 缺血组再灌注48h后海马CDK4表达升高,凋亡细胞增多,针刺组CDK4表达和凋亡细胞明显减少(P<0.01)。结论 针刺对脑缺血再灌注损伤有保护作用,其机制可能与调控细胞周期因子从而抑制凋亡有关。

【关键词】  针刺;脑缺血;细胞周期;凋亡

  ABSTRACT:Objective To investigate the effects of acupuncture on expression of CDK4 protein in neurons and neuronal apoptosis after focal cerebral ischemia reperfusion in rats.Methods A model of middle cerebral artery occlusion(MCAO) in rats was established with intraluminal filament occlusion.Acupuncture was conducted on rats after reperfusion.The immunohistochemistry,western blot and flow cytometry were used respectively to detect the expression of CDK4 protein and neuronal apoptosis in hippocampus.Results A significant increase in CDK4 immunostaining and apoptotic neurons was detected at 48h after reperfusion.The differences of immunoreactivity of CDK4 and apoptotic neurons between ischemic group and acupuncture group were significant(P<0.01).Conclusion Acupuncture can protect cerebral tissues by regulating cell cycle factors and inhibiting cell apoptosis in ischemia reperfusin injury.

  KEY WORDS:Acupuncture;Cerebral ischemia;Cell cycle factor;Apoptosis

  海马与学习、记忆、动机及情绪等功能密切相关。局灶性脑缺血可损伤远隔部位的海马出现神经元丢失及神经胶质细胞增殖[1],形成一种类似海马硬化的病理改变。海马神经元丢失是引发认知障碍的基础病理变化之一[2]。针刺对脑缺血再灌注损伤有保护作用。在脑缺血再灌注损伤中,细胞周期与神经元凋亡有着密切的关系。本研究旨在探讨针刺是否通过对细胞周期的调控发挥抗凋亡作用。

  1 材料和方法

  1.1 试验动物和分组

  成年健康雄性SD大鼠36只,体质量200~250g,清洁级,华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。随机分为对照组、缺血组和针刺组,每组12只。

  1.2 大脑中动脉闭塞(MCAO)再灌注模型的建立

  参照Koizumi等[3]方法制作大鼠左侧大脑中动脉阻塞及再灌注模型。采用10%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉, 术中维持动物肛温(36.6±0.5)℃,颈部正中切口,分离并结扎左侧颈总动脉、颈外动脉,注意避免刺激迷走神经。从颈总动脉分叉处插入4.0丝线,沿颈内动脉进入距颈总动脉分叉处1.8~2.0cm略感阻力时停止;30min后拔出丝线进行缺血再灌流。术后在约20℃的空调环境下单笼饲养,自由进食、进水。对照组只暴露血管。

  1.3 针刺方法

  按照《实验针灸学》[4],取水沟、内关、曲池、足三里4穴,强刺激手法,交替行针5min。再灌后开始,2次/d。

  1.4 标本采集和处理

  再灌48h后断头取脑,各组取6份-8℃冰箱冻存备用做Western?blot和流式细胞仪检测,另外6份常规灌注固定,石蜡包埋,切片做免疫组化检测。

  1.5 Western?blot检测

  海马样品制备、蛋白浓度测定、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳以及转移电泳,最后进行化学发光法显影,其过程大致如下:0.1%TTBS洗PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭2h,1∶200兔多克隆CDK4一抗(Santa Cruz Biotech, Inc.)4℃孵育过夜;0.1%TTBS洗膜,1∶200稀释的HRP抗兔二抗室温孵育1h,0.1%TTBS洗,15min×4次,最后在暗室中进行化学发光法显影,高敏感胶片摄片、洗片。

  1.6 免疫组化检测

  3%H2O2孵育10min,0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)中微波修复(96℃~98℃)10min,自然冷却至室温。正常血清封闭30min,倾去血清,滴加CDK4兔多克隆抗体,4℃孵育过夜。滴加生物素标记的二抗稀释液,滴加辣根酶标记的链酶卵白素稀释液,室温孵育45min,DAB显色至自来水终止。脱水、透明并封片。常规设立阴性对照。光镜下观察CDK4的表达,以胞浆胞核棕黄色着色的细胞为阳性表达的细胞。

  1.7 凋亡检测

  流式细胞计数检测凋亡:大鼠脑海马剪碎后以0.25%胰蛋白酶于37℃消化30min,以等量生理盐水终止消化,经200目筛网过滤,离心,以PBS洗2次,调整细胞数为1×106/ml,双标(PI, Annexin?v)检测凋亡。

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